İMMUNOHİSTOKİMYA

Renk Cümbüşünden Tek Renkli Bir Evrene

Çoğu pozitif düşünce akımlarında, evrimin ve bilimsel eylemlerin başlangıcının belirlenmesinde yazılı kaynakların katkıları aranır. Yazılı kaynaklar Patolojinin başlangıcını eski Mısır uygarlığına götürmek-tedir.  Bu kaynakların en önemlileri papirüs üzerine yazılmış iki adet belgedir: Edwin Smith Papirüsü (İ.Ö.17.) ve Papyrus Ebers (İ.Ö.1550ler).
Arkeologların bir bölümü ise, antik kentlerde buldukları iskeletlerde izledikleri patolojileri değerlen-dirme çabasına girmişler, fizik antropologlar ile işbirliğine gitmişlerdir; bu çabalar “Paleopatoloji” bilim dalının doğmasına yol açmıştır.

Bodrum’un karşısındaki Kos (İstanköy) adasında yaşamış olan Hippocrates’ın (İ.Ö. 460–370) tıp ve patoloji ile ilgili varsayımları günümüze dek etkili olmuştur.
İlk otopsi ya da diseksiyon girişiminin Herophilos (İ.Ö.335–280) ve Erasistratos (İ.Ö. 304–250) tarafından İskenderiye’de (Mısır) yapıldığı belgelenmiştir.  300 yıl sonra Romalı Cornelius Celsus “yangı (enflamasyon)” ile ilgili ilkeleri koymuş, Bergamalı Galen “kanser” olgusunu tanımlamıştır. Hippocrates’ın etkisinde geçen yıllar 1270’e ulaştığında İtalya’da (Bologna Üniversitesi) anatomi ve patolojik anatomi eğitimi amaçlı diseksiyonlara başlanmıştır. İlk patoloji kitabını İtalyan hekim Antonio Benivieni (1443–1502) yazmıştır. Hastalıkları ilk kez sınıflandıran Jean Fernel (1497–1558) aslında bir matematikçi ve astronomdur.
Giovanni Batista Morgagni (1682–1771) ile öğrencisi Antonio Valsalva’nın (1666–1723) anatomi ve patolojiye önemli katkıları olmuştur. Patoloji 18. ve 19. yüzyılda Thomas Addison (1793–1860), Thomas Hodgkin (1798–1866), Carl von Rokitansky (1804–1878) ve Rokitansky’nin öğrencisi Rudolf Virchow (1821–1902) ile doruğa ulaştı.

Bu dönemde morfolojik bilimlerde devrim yapacak bir buluş gerçekleşmişti: mikroskop. İsa’dan önceki yıllarda, içi suyla dolu bir borunun ucuna yerleştirdikleri mercekle yazıları ve cisimleri büyütmeye çalışan Çinlilerden önce eski Mısır’da suyun büyütme ve ışığı kırma niteliklerini bilen bilginler bunu işgalci Romalılara öğretmişlerdi bile. Optik fiziğinin gelişmesi ile ilk mikroskopun üretilmesi –çoğu bilim dalının evriminde olduğu gibi- yüzyıllarca süren çabaların ürünleridir. Optik fizikteki ilk adımları eski Mısır, eski Yunan ve eski Orta-Güney Amerika uygarlıklarının attıkları konusunda farklı görüşlerin varlığına karşın ilk yazılı belgenin Euclid’e (İ.Ö.300ler) ait olduğu bilinmektedir.
Mısır'da savaşan ataları Romalıların İskenderiye’den topladıkları bilgileri değerlendiren Salvino D'Armate 1284 yılında merceklerden yararlanarak ilk gözlükleri üretti.
Claudius Ptolemy ışığın kırılmasını, Basralı Ibn-el-Haitham sferik ve parabolik aynaları, Salvino D'Armate ilk gözlük denemelerini, Johannes Kepler görme fizyolojisini ve görme kusurlarının mercekler kullanarak düzeltilmesinin ilkelerini, Galileo Galilei ilkel teleskopun geliştirilmesi çabalarını sürdürürken ilk mikroskop taslağı Hollandalı gözlükçü Zacharias Janssen ile ailesinden geldi (1590).  Gözlük üretimi yapan Hollandalı Janssenler –Çindeki çabalara benzer bir kurguyla- bir boru içine ve uçlarına mercekler yerleştirerek mikroskop kavramının ilk adımını attılar. 1609’da Galileo Galilei mikroskopta konkav ve konveks mercekler kullanarak büyük bir adım attı ve 1612 yılında geliştirdiği birkaç mikroskop örneği Avrupalı optikçilerin yoğun ilgisini çekti. 62 yıl boyunca süren çok sayıdaki deneme 1674’de -yine bir Hollandalı- Leeuwenhoek tarafından kurgulanan gerçek mikroskop düzeneği ile önemli bir gelişme gösterdi.  Üniversite eğitimi olmayan Antonie Philips van Leeuwenhoek oluşturduğu boru-mercek düzeneği ile bakterileri bile görülebilecek kadar büyütebilen sistemi geliştirip dünyaya duyurduğunda 42 yaşındaydı.  Bu aşama Anatomi’nin, Histoloji’nin, Mikrobiyoloji’nin ve Patoloji’nin dönüm noktası oldu.
Antonie Philips van Leeuwenhoek’un ilk mikroskopu kullanmasından 200 yıl kadar sonra Çanakkale’nin Hisarlık yöresindeki Truva, Agememnon’un askerlerinin bile yapmadığı kadar yıkılarak Priamos hazinesi yağma edildi. Kimilerinin hayranlık duyduğu ve arkeolojinin kurucusu olarak nitelendirdiği Heinrich Schliemann patlayıcı kullanarak yıktığı surlarda bulduğu hazineyi önce Yunanistan’a oradan da Almanya’ya kaçırdı. 1867 yılında Paris’teki bir sanat sergisine davet edilen zamanın Osmanlı Sultanı Abdülaziz bu geziden dönüşünde Almanya’ya da uğramış, belki de Berlin’de Heinrich Schliemann ve Dr. Rudolf Ludwig Carl Virchow ile tanışarak Truva kazıları için söz vermişti. 1870 yılında Dr.Virchow ile birlikte İstanbul’a gelerek yazılı kazı onayı alan Schliemann 1873 yılı Mayıs ayında, gerçekte kendisinden 15 yıl önce Hisarlık surlarına ulaşmış olan İngiliz arkeolog Frank Calvert’in anılarını okumuş ve çok iyi kavramıştı. Yeni bulunmuş bir patlayıcı olan dinamitle geldiği surları patlatarak çağının en büyük soygunlarından birini gerçekleştirdi.
   Truva duvarlarının dinamitlendiği yıllarda antropolojiyle de ilgilenen, siyaset alanında Bismarck ile kapışan bir hekim olarak gördüğümüz Virchow “modern patolojinin kurucusu” olarak bilinir. 1846’da başladığı Patoloji asistanlığı döneminde Prusya’daki salgın hastalıkların nedeninin yoksulluk olduğunu görünce devrimcilerin yanında saf tutmuştur.  Çoğu devrimci aydın gibi Berlin’den kaçan Virchow Würzburg Üniversitesi’ndeki çalışmaları ile “hücre patolojisi” ve “modern patoloji” kavramlarının temelini atmıştır. Araştırmalarını gören ilgililerin onu yeniden Berlin’e çağırması üzerine 1856’da Berlin Üniversitesi’nde kurulan Patoloji Enstitüsü’nün başına geçmiş, ölene dek patoloji, antropoloji ve siyaset üçgeninin köşeleri arasında mekik dokumuştur.
Virchow, bir süre önce Theodore Schwann (1810-1882)’ın başlattığı  “hücre” kavramı üzerine kurduğu “hücre patolojisi” kuramını tanımlarken canlı organizmadaki tüm aksamaları -çağdaşı Karl Marx’ın etkisinde de kalarak-  “hücrelerarası olumsuz etkileşimlerin sonucu” olarak nitelemiş; Omnis cellula e cellula (her hücre başka bir hücreden kökenlidir) derken günümüzdeki “kök hücre” ile “rejenerasyon” ve “tümör” patogenezinin temellerini atmıştı. Patoloji deneyimlerini klinik gözlemlere, hayvanlar üzerinde yapılan deneylere, özellikle de doku ve hücre düzeyindeki mikroskop incelemelerine borçlu olan, yangı (enflamasyon) olgusunu ve tümör oluşumunu titizlikle araştıran Virchow  “enfeksiyon” kuramına asla inanmamış, Pasteur’ün “canlı etkenlerin insan organizması üzerindeki etkileri” konulu konferansının bitiminde meslektaşını kutlamadan öfkeyle ayrılmıştı salondan.
   Johannes Purkinje (1787-1869)’nin mikrotom işlevi gören araçları kullanıma sunmasıyla birlikte hücreler, dokular ve organlar ile ilgili bilgiler sel gibi akmaya başladı: göz sinirleri ve gözdeki Schlemm kanalı (Friedrich Schlemm); kemiklerdeki Volkmann kanalları ve sempatik sinir sistemi (Alfred Wilhelm Volkmann); sinir sistemi ve duyular, kadın genital sistemindeki Müller kanalı, endokrin sistem (Johannes Peter Müller); kemiklerdeki Sharpey lifleri ve epitel hücrelerinin siliaları (William Sharpey); lenfatik sistem, kıllar, mucus, irin, epitel türleri, böbrekteki Henle kulpu (Friederich G. J. Henle); hücre/doku ilişkisi, Schwann hücreleri (Theodore Schwann); derideki Vater-Pacini cisimcikleri, Vibrio cholera (Filippo Pacini); böbrekte glomerüllerin Bowman membranı, gözde korneanın Bowman membranı, burun mukozasındaki Bowman bezleri (Sir William Bowman); timustaki Hassall cisimcikleri, gözde Hassall-Henle cisimcikleri (Arthur Hill Hassall); retinadaki nöroglial Müller lifleri, corpus ciliare (Heinrich Müller) başlıca örnekler olarak verilebilir.  1887’de Prens Frederick’e yapılan larinks biyopsisinden mikrotom kullanılarak hazırlanan kesitlerin mikroskopla incelenmesi Cerrahi patolojinin ilk uygulamasıdır; kesitler Virchow tarafından incelenerek rapor edilmiştir.

İMMUNOHİSTOKİMYA
   Mikroskop büyük aşamalar gösterirken 1825’de François-Vincent Raspail ile başlayan histokimya Virchow’un 1856’da Berlin Üniversitesi Patoloji Enstitüsü’nde çalışmaya başladığı yıllarda büyük ataklar yapmıştı. 20.yüzyıla gelindiğinde konuyla ilgili çok sayıda yayın vardı. Mikroskop karşısına geçen morfologlar çok renkli bir dünyada gezinirken her ay yeni bir yöntemle yeni hücreler ve ürünleri tanımlanıyordu.
   Deneysel araştırmalar, hücreleri ve dokuların ürettiği kimyasal maddeler ile bunların birbirleri üzerindeki etkileri moleküler biyolojinin ve moleküler patolojinin doğmasına yol açtı.
   Temel Bilimler’in önemli bir dalı olan Moleküler Biyoloji geliştikçe Moleküler Patoloji’nin de adımları hızlanıyordu. Tetiği ilk çeken Marrack oldu; kan proteinlerinden tifüs ve kolera etkenlerine karşı oluşmuş antikorları elde etti. Antikorları benzidin tetraedro ile işaretleyerek bağlandıkları antijenleri kırmızı renge boyadı.
   Bir Patolog ve İmmunolog olan Prof. Coons  immunohistokimyanın üç temel bilgiyi içerdiğini gördü: immunoloji, histoloji, kimya. Kimyadaki en basit ilke immunohistokimyanın da temel ilkesiydi: antijen + antikor = antijen-antikor kompleksi (immun kompleks). Bu süreci iyi kavrayan Coons benzer bir mantıkla Pnömokoklara karşı oluşmuş antikorları floresan veren bir madde olan anthracene isocyanate ile işaretleyerek bakterilerin özel mikroskopla görülebilmesini sağladı. Bu ilke günümüzde de immunofloresan mikroskopinin temel ilkesiydi.

   İmmunofloresans tekniğinin dondurulmuş taze dokulardan elde edilen kesitlere uygulanabilmesi immunohistokimya çalışmalarının en önemli engeliydi. Bu engeli aşmaya yönelik çabalar 1966 yılında dünyanın iki farklı yöresinden geldi; Avrameas ve Uriel ile Nakane ve Pierce antijen-antikor komplekslerinin başka yöntemlerle de görülebileceğini kanıtladılar. Çok geçmeden peroksidaze-antiperoksidaze (PAP) tekniklerinin ilk filizleri belirdi; önce Nakane, bir yıl sonra da Mason ve ark, Sternberger ve ark, Mason ve Sammons. Birkaç yıl sonra da “alkalin fosfataze ve monoklonal anti-alkalin fosfataze (APAAP)” gibi gelişmiş teknikler sunuldu.
   Enzimlerden yararlanarak östrojen reseptörlerini belirleyebilen Aasmundstad ve ark immunohistokimyada yeni kapılar açtılar.

   İmmunohistokimya yöntemleri geliştikçe istenilen yapıları uygun antikorlarla görebilmenin niteliği de artmaktaydı.  Bu dönemde Avidin-Biotin uygulamalarının sağanağı başladı.
   Nitelik geliştirme çabaları arasında frozen kesitlerine dönme çabaları ve fiksasyonlarla ilgili kuşkular öne çıktı, yeni teknikler önerildi.  Ancak nitelik uzun süre yetersiz kaldı. Çok nitelikli renk dağılımı saptanan kesitlerde pozitif ya da negatif boyanmaların niceliklerini de bilmek gerekiyordu.  Araştırmacıların bir bölümü niceliksel ölçütlerin belirlenmesi ve standardizasyonu, belirlenen ilkelere uygun bilgisayar desteğinin geliştirilmesi ve görüntü analizi programlarının oluşturulması çabalarına giriştiler.
   Standardizasyonu etkileyen bir başka etken “teknik personel” ile ilgiliydi. Tekniker kusurlarını ortadan kaldırmaya yönelik uğraşlar (robotik laboratuvar önerileri ve çalışmaları) immunohistokimya laboratuvar tekniklerinin büyük bir gelişme gösterdiği 1980-1990 arasında yoğunlaştı.  Günümüzde immunohistokimya laboratuvarlarının yaygın olarak kullanıldığı robotik sistemleri üreten firmalar arasındaki kıyasıya savaş ve rekabet giderek artmaktadır. İmmunohistokimyada ilk girişimler infeksiyon hastalıklarının etkenlerini belirlemek amacına yönelikti. Çağdaş patolojide güncelleştirilmiş immunohistokimya yöntemleriyle çok sayıda araştırma ve inceleme yapılabilmektedir:
(a) Canlı etkenlerin belirlenmesi: H.pylori, T.pallidum, H.capsulatum, virüsler (HHV1, HHV2, CVM, HHV8),  parazitler (T.gondii, P. jiroveci) ile kimi mikobakteriler,
(b) Nöropatoloji: dejeneratif beyin hastalıkları ile distrofik kas hastalıklarının tanısı ve izlenmesinde de önemli katkılar sağlamaktadır.
(c) Sitolojik materyalin incelenmesi: immunositokimya,
(d) Deneysel araştırmalar,
(e) Yangı (inflamasyon): yangı hücreleri, medyatörler, vb,
(f) Reseptörler: östrojen, androjen, vd,
(g) Hücre siklusu: apoptozis, vb,
(h) Tümörlerin tanısı ve izlenmesi.

TÜMÖR MARKERLERİ

İmmunohistokimyanın en önemli atılımlarından biri “tümör markerleri”nin bulunmasıyla gerçekleşti.  Onkolojik patolojiye özgü markerlerin nitelikleri, tümör hücrelerinin kaynaklandıkları ya da taklit ettikleri normal hücrelerin içerikleri ya da ürettikleri maddelerin niteliklerinden farksızdır, farklılık niceliktedir. Markerlerin çoğu protein niteliğindedir. Gen mutasyonlarının belirteci olan markerler ise genlerin ya da DNA yapısındaki değişmelerin belirlenmesi ilkesine dayanır (genomik markerler). Enzimler, onkogenler, tümörlere özgü antijenler, proliferasyon markerleri ve tümör süpressör genleri immunohistokimyasal yöntemlerle gösterebildiğimiz tümör markerlerinin başlıcalarıdır.

Onkolojik patolojideki uygulamaların çok önemli yararları vardır:
   1- İndiferansiye tümörlerin tanısı kolaylaşır;
   2- Tümörlerin sınıflandırılması kolaylaşır (örneğin lenfomalar gibi kimi tümörler alt gruplara ayrıldığında daha özgün tedaviler uygulanabilmekte);
   3- Klinikte primeri saptanamayan metastazların primeri belirlenebilir;
   4- Tümör tedavisinde uygulanacak yöntem, tedaviye yanıt ve prognoz izlenebilir;
   5- Tümörlerin agresyon potansiyeli saptanır.

Patolojide markerleri genellikle dokularda ararız. Klinikte ise kan, idrar, dışkı, viseral boşluklardaki sıvılarda belirlemeye çalışılır. Serolojik yöntemlerle saptanan markerler, tümör tanısı için yapılan biyopsilerden alınan doku örneklerindeki markerlerin yerini dolduramaz. Histopatolojik olarak tümör/kanser tanısı konulmamış olgulardaki kan, idrar, dışkı, vb markerler ancak bir uyarı olarak algılanır. Serolojik yöntemlerle incelenen markerler biyopsi ile tanısı konulmuş bir kanser olgusunda, uygulanan tedavi yönteminin başarısını ve prognozu izlemekte yardımcı olabilmektedir.
Prens Frederick’e yapılan larinks biyopsisi ile başlayan cerrahi patolojinin ilk uygulamasından bugüne dek özellikle tümör immunohistokimyasına özel bir önem verilmiştir. Meme kanseri, akciğer kanseri, prostat kanseri, lenfomalar, beyin tümörleri gibi olgular ile ilgili araştırmalarla ilgili sunumlar bilimsel dergilerin ve toplantıların ana konuları olma önceliğini sürdürmektedir.

ORAL MUKOZANIN PREKANSERÖZ LEZYONLARINDA ve SKUAMÖZ HÜCRELİ KARSİNOMLARINDA UYGULANAN MARKERLER

Moleküler patoloji ve diagnostik genetik çalışmalarında kullanılan çeşitli tekniklere her geçen gün bir yenisi eklenirken oral patoloji uygulamalarında 4 temel amaç izlenir;

(a) Prekanseröz mukoza lezyonlarında invazif nitelik kazanma eğiliminin önceden belirlenebilmesi,
(b) İndiferansiye tümörlerde ayırıcı tanı yapabilmek,
(c) Cerrahi yöntemlerle çıkarılmış prekanseröz ve kanseröz lezyonların prognozuyla ilgili ipuçları elde etmek,
(d) Çene kemiklerine metastaz yapmış tümörlerin primerini belirlemek.
Örneğin, her an patlamaya hazır bir bomba gibi görülen in situ karsinomlardaki (CIS) ve ileri düzey epitel displazilerindeki olası davranış değişikliğini belirlemek amacıyla çok sayıda immunohistokimya paneli uygulanır. Ayrıca rezeksiyon sınırlarında pozitif boyanma saptanan olgularda bir süre sonra residiv meydana geleceği öngörülür.

Baş-Boyun Patolojisi Çalışma Kümesi’nde tümörlere uygulanan panellerin içeriğinde kullanılan antikorların bir bölümü ağız mukozası lezyonları için de kullanılmaktadır.

 1. Genomik markerler
DNA'daki, kromozomlardaki, onkogenlerdeki ve tümör süpressör genlerindeki değişikliklerin saptanmasında kullanılırlar.
1.1. DNA aneuploidy: Bir hücredeki DNA içeriğinin değişmesi, o hücrenin genetik davranışlarının değişmesi anlamına gelir. Normal hücreler -DNA içeriği de normal olduğu için- genetik açıdan duragan (stabil) hücrelerdir. Buna karşın kanser hücreleri -DNA içeriğinin değişmesi nedeniyle- genetik açıdan değişken (labil) bir nitelik kazanır.
Ağız mukozasının skuamöz hücreli karsinomlarında "flow cytometry" ve "image cytometry" yöntemleriyle DNA içeriği belirlenerek hastalığın prognozu ile ilgili verilere ulaşılır. Örneğin, DNA içeriği normal olan lezyonlarda kanserleşme riskinin az, aberan DNA içeriği bulunanlarda ise yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu yöntem, invazif karsinoma değişme eğilimi gösteren prekanseröz lezyonların prognozunu önceden kestirebilmekte yararlı olmaktadır.
Klinik uygulamada insizyon biyopsisi yapmadan, fırça (brush) ya da yüzey kazıması yöntemleriyle alınan örneklerdeki başarı oranının %97’nin üzerinde bulunması önemli bir kazanımdır.
1.2. Heterozigositenin yitirilmesi: bir kromozom çiftindeki genomik materyallerden birinin yitirilmesidir. Kromozomlardaki heterozigositenin yitirilmesi tümör süppressör genlerinde olumsuzluklara ve inaktivasyona neden olmaktadır. İnsan organizmasındaki kanserlerin çoğu tümör süpressör genlerindeki bozuklukların sonucudur. Kromozomların 3p, 4q, 8p, 9p, 13q ve 18 q kollarının yitirilmesi oral prekanseröz ve kanseröz lezyonların oluşmasına yol açabilmektedir. Prekanseröz lezyonlarda heterozigosite yitirilmesi kanserleşme eğiliminin erken belirtisi olarak kabul edilir; 3p ve 9p kollarının yitirilmesi, kromozomların öteki kollarından herhangi birinin yitirilmesine oranla yaklaşık 4 katı daha fazla etkindir. 3p, 4q ve 9p kollarına ek olarak başka bir lokusun da yitirilmesi kanserleşme olasılığını 33 kat arttırmaktadır. 3p, 4q ve 9p kollarının yitirilmesi özellikle ağız tabanı, dil kenarları ve yumuşak damak karsinomlarında sık rastlanan bulgulardandır. 4q kolunun yitirildiği olgularda tümörün daha progressif geliştiği gözlenir.
1.3. p53 (P53): hücrelerin proliferasyonunu denetleyen, otonomi eğilimi gösteren hücrelerin ortadan kaldırılmasını ve böylece tümör oluşumunu engelleyen bir TP53 ailesine özgü bir gendir (tümör geni). Bu genin kodladığı protein (p53 proteini) öncelikle hücrelerin genetik yapısını etkileyebilecek zararları önler ve hücredeki genetik yapı bozukluklarını düzeltme çabası gösterir. Yapı bozukluklarını düzeltme çabası yetersiz kalırsa genetik yapısı bozulan hücrenin ortadan kaldırılmasına çabalar. p53 proteini niceliği normal hücrelerde ve displastik epitel hücrelerinde immunohistokimya yöntemleriyle gösterilemeyecek kadar azdır. p53 artışı (mutasyon) prekanseröz lezyonlardaki kanserleşme eğiliminin erken bulgularındandır.
Mutasyona uğrayan p53 proteini tümör hücrelerini etkileyebilme gücünü yitirir. Kanserli dokularda mutasyonlu p53 yığılması immunohistokimya yöntemleri ile kolayca gösterilebilen ve ayırıcı tanı yöntemi olarak kullanılan değişikliklerden biridir.
Eritroplakilerde ve skuamöz hücreli karsinomların erken evresinde mukozanın parabazal hücrelerinde p53 yığılması saptanır.
Dokularda mutasyona uğramış p53 proteininin gösterilmesi önemli bir histopatolojik bulgu olsa da tek başına değerlendirilmemeli, ayırıcı tanıda yararlı başka yöntemlerle birlikte uygulanmalıdır.
Ağız mukozasının skuamöz hücreli karsinomlarında p53'ün Ki-67 ile birlikte pozitif olması tümörün progresyonu, histolojik grade'i ve metastaz eğilimi ile uyumludur.
Yaşlılarda ağız mukozası p53 düzeyleri artar.
1.4. p63: p53 gibi TP53 ailesinin bir başka üyesi olan p63 proteini ile ilgili araştırmaların sonuçları da prekanseröz lezyonların kanserleşme eğilimi konusunda bilgi verebilir. Normal epitelin bazal hücrelerinde saptanan p63, displastik değişiklikler gösteren olgularda parabazal ve spinal hücrelerde de bulunur. Ağır displazilerde displazinin olduğu her kesimde, CIS olgularında ise tüm katmanlarda pozitif boyanma izlenir, özgün bir anlamı yoktur.

   2.Diferansiyasyon markerleri (ABO)
Prekanseröz ve kanseröz hücrelerdeki diferansiyasyon düzeyinin belirlenmesinde kullanılan yüzey antijenleri ve keratin belirteçleridir.
2.1. Yüzey antijen markerleri: hücre yüzeylerine bulunan, kan grupları ile doku gruplarını belirleyen antijenlerdir (doku-kan grupları antijenleri, ABO antijenleri, Lewis ve T/Tn sistemleri). Bu tür antijenler ağız mukozasındaki çok katlı yassı epitel hücrelerinin yüzeylerinde de bulunurlar. Kanserleşme eğilimi gösteren epitel hücrelerinde diferansiyasyon yetersiz olduğu için yüzey antijenlerinin sentezi de bozulur. Sentezi bozulan yüzey antijenleri ya tümüyle kaybolur ya da bulunmamaları gereken hücrelerin yüzeylerine saptanırlar. İmmunohistokimya teknikleri prekanseröz ve kanseröz lezyonların çok erken dönemlerinde saptanan yüzey antijeni bozukluklarının belirlenmesinde kullanılır. Örneğin, prekanseröz bir lezyonun hücrelerindeki doku-kan grubu A antijeninin yokluğu, kanserleşmenin çok önemli bir habercisidir. Kanser hücrelerindeki doku-kan grubu A ve B antijenlerinin yokluğu ise, tümördeki güçlü invazyon yeteneğinin ve kötü prognozun göstergesidir.
2.2. Keratin markerleri (sitokeratinler): displastik lezyonlardaki diferansiyasyon bozukluklarını gösteren belirteçlerden biridir. Monoklonal ve poliklonal keratin antikorlarının kullanıldığı boyama teknikleri skuamöz hücreli karsinomların belirlenmesinde önemli bir yer tutar. Özellikle monoklonal antikorlarla boyanan skuamöz hücreli karsinomlarda keratin proteinlerinin dağılımındaki düzensizlik patognomonik bir bulgudur.
Keratin skuamöz (çok katlı yassı) epitel hücrelerinin hücre iskeletini oluşturan proteinlerdendir (cytokeratin). Bilinen 20 adet keratin vardır (CK1-CK20). Malign değişmelerle birlikte hücre iskeletinde bulunan keratin proteinlerinin tipinde ve dağılımında değişiklikler saptanır. Normal koşullarda bazal tabaka hücrelerinde bulunan CK5/CK14 ikilisi displastik değişiklikler gösteren epitelde parabazal ve spinal hücrelerde saptanır. Spinal hücrelerde ve keratinleşme alanlarında bulunan CK4/CK13 ile CK1/CK10 ikilileri ileri displazilerde tümüyle kaybolurlar. CK8/CK18 ikilisi displastik değişikliklerin bulunduğu alanlarda pozitif sonuç verebilir. CK19 normal epitelin bazal tabaka hücrelerinde görülürken orta-ileri derecede displazilerde ve CIS'da bazal tabakanın yanı sıra suprabazal hücrelerde de pozitif sonuç verir. Hücre pleomorfizmi arttıkça tümör hücrelerindeki CK19 niceliğinin de arttığı görülür. İlginç olan, CK19' un gingivitisli bölgelerdeki dişeti epitelinde diffuz bir dağılım göstermesidir.
Bir başka bulgu CK4, CK13, CK1 ve CK10 gibi diferansiyasyon belirteçlerinden yararlanarak grading yapılabileceğidir. Ağır epitel displazilerinde ve az diferansiye tümör hücrelerindeki yoğun boyanmalar, hücrelerdeki diferansiyasyon ve matürasyon bozulmasının göstergesidir.

   3. Proliferasyon markerleri (Kİ67)
Epitel hücrelerindeki çoğalma hızının saptanmasında kullanılan belirteçler-dir. Hücre siklusunu kontrol eden siklinler (cyclin) ile kinase enzimleri (CDK) hücrelerin gereğinden fazla çoğalmalarını engeller. Genetik yapısı bozulan hücrelerin proliferasyonu kontrol edilemez. p53 proteini ile ilgili olan p21 sikline bağlı kinaze inhibitörlerinden biridir; p21 düzeyi arttıkça tümörün büyümesi hızlanır, agresyonu artar, prognoz kötüleşir. Histokimyasal yöntemlerle incelenen prekanseröz lezyonlardaki Cyclin (cyclin D-1) ve CDK düzeylerindeki azalma kanserleşme eğiliminin göstergelerinden biridir.
Ki-67 gibi bir progresyon belirteciyle birlikte uygulanarak yapılan değerlendirmelerin sonuçları lezyonun prognozuyla ilgili mikroskopik yorumların daha kolay yapılabilmesini sağlar.

   4. Progresyon markerleri
Genellikle tümörlerde bulunan ve bir tümörün progresyonuyla ilgili ipuçları veren maddelerdir.
Survivin birçok tümörde bulunan bir apoptozis inhibitörüdür. Ağız mukozası-nın prekanseröz lezyonlarında survivin saptanması invazif karsinoma dönüşme eğiliminin erken belirtisidir. İnvazif karsinomların tümünde survivin pozitiftir.

Ağız kanserlerinin progresyonunda hücre proliferasyonundaki artış kadar apoptozis düzeninin bozulması da etkilidir; apoptozis süpresyonunu (bcl-2) ve diferansiyasyonu (pozitif Ki-67) belirlemede yardımcı olan teknikleri değerlendirmek progresyonu belirleme çabalarına yardımcı yöntemlerdir.
Tumor growth factor (TGF), tümör progresyon belirteçlerine bir başka örnektir, Skuamöz hücreli karsinom niteliği kazanmış olgularda, özellikle periferik kesimlerindeki güçlü TGF-alpha varlığı tümörün agresyonu ile ilgili ipuçları verebilir.

CD44v9 niceliğindeki azalma skuamöz hücreli karsinomların lenfatik yolla metastaz yapma eğilimini belirlemede kullanılan bir belirteçtir.
MUC1 tümörlerde bulunan, müsine benzer özellikler taşıyan glikoproteindir. Ağız mukozası lezyonlarında MUC1 bulunması prekanseröz ve kanseröz lezyonların varlığını gösterir. Skuamöz hücreli karsinomlarındaki hücre membranına özgü MUC1 niceliği arttıkça, tümörün invazyon ve metastaz gücünün de arttığı belirlenmiştir.

İncelenen kesitlerde CXCL13 (chemokine ligand-13) saptanması kemik invazyonu ve osteolizis belirteci olarak anlamlıdır.

Hücre proliferasyonlarında, diferansiyasyonunda ve apoptozis sürecinde önemli işlevleri olan mikroRNA’lar (miRNA) son yıllarda kimi kanserlerin prognoz ve agresyon belirteci olarak önemli katkılar sağlamaktadır. Oral skuamöz hücreli kanserlerde miR-21 öne çıkar, miR-205 ise skuamöz hücreli malign olgularda olduğu kadar benign olgularda da pozitiftir.

   5. Adhezyon markerleri
Moesin, aktin filamentlerini hücre yüzeyine bağlayarak hücrelerin birbirine yapışmalarını sağlayan bir yüzey komponentidir. Normal ağız mukozasında ve deride sağlıklı bazal ve spinal hücrelerin yüzeyini kuşatır. Displastik değişiklikler gösteren epitel hücrelerinin yüzeylerindeki moesin niceliği stratum corneum katmanına yaklaştıkça azalır. Skuamöz hücreli karsinom hücrelerindeki moesin yerleşimi intrasitoplazmik nitelik gösterir, hücre yüzeylerinde yoktur. Bu nitelik tümör hücreleri arasındaki bağlantı yetersizliğinin en önemli nedenlerinden biridir.

   6. Angiogenezis markerleri
Angiogenezis kapiller damarların yerel proliferasyona bağlı damarlanma artışı olgusudur. Kanserlerin büyük bir bölümünde angiogenezisi uyaran

G-CSFR (granulocyte-stimulating factor receptor), VEGF (vascular endothelium growth factor) ve PD-ECGF (platelet-derived endothelial cell growth factor) gibi çeşitli faktörlerin üretildiği saptanır.  Etkin faktörlerin gücü oranında tümör çevresindeki damarlanma artar.  Başlangıçta periferik alanlarda beliren damar artışı tümör büyüdükçe kitlenin içlerine dek ilerler. Yeni oluşan kapillerlerin kimi segmentlerinde lümenleri tümör hücrelerinin döşediği saptanır.
Epitelyal displazilerde ve skuamöz hücreli karsinomlarda özellikle G-CSFR'nin varlığı saptanır. G-CSFR'nin yoğunlaştığı bölgelerde, endotel hücrelerine özgü bir glikoprotein olan CD34 ile prolifere olan hücrelerdeki çekirdek antijeninin (PCNA) varlığı güçlü angiogenezisin belirteci olarak kabul edilmektedir.
Endotel yüzey adhezyon molekülleri (CD31, CD13/APN) ve hücre yüzey proteinleri (integrin) ile yapılan araştırmalarda displastik değişiklik gösteren hücrelerin progresyonu ile ilgili önemli ipuçları belirlenmiştir.
Tümör angiogenezisinde mast hücrelerinin de önemli etkisi bulunur; intratümöral mast hücresi yoğunluğu angiogenezisin ve invazif karsinoma dönüşme eğiliminin önemli bir bulgusu olarak kabul edilmektedir. Tümörü kuşatan alanlardaki mast hücresi yoğunluğu ise bağ dokusu yıkımının ve invazyon gücündeki artışın göstergesidir.
IL-8 akut yangılarda nötrofil kemotaksisine ve endotel proliferasyonuna neden olan bir sitokindir. Skuamöz hücreli karsinomlarda (özellikle en agressif kesimlerinde) tümör hücrelerinin ürettiği güçlü IL-8 varlığı saptanır. Tümör hücrelerinden kökenli IL-8 vasküler proliferasyonu hızlandıran bir başka faktördür. İnfiltrasyon alanlarındaki fibrin niceliği arttıkça tümör hücrelerinin daha fazla IL-8 ürettiği saptanmıştır.
Lenf damarlarının proliferasyonu (lenfangiogenezis) tümör hücrelerinin lenfojen yayılmasını kolaylaştırması nedeniyle kan damarlarının proliferasyonu kadar önemlidir. Tümörde ve lenfatiklerin endotel hücrelerinde saptanan VEGF-C (vascular endothelium growth factor) lenfangiogenezisi uyaran önemli bir faktördür. Lenf damarlarının proliferasyonu tümörün periferik kesimlerinde daha belirgindir.

ODONTOGEN KİSTLER ve TÜMÖRLERDE UYGULANAN MARKERLER

Odontogen kistlerin ve odontogen tümörlerin immunohistokimyasal açıdan incelenmelerinde kullanılan tekniklerin ve panellerin çok büyük bir bölümü oral mukoza tümörlerinin incelenmesi için uygulananlardan önemli farklılıklar göstermez.

 CD 31, CD34, CD105, VEGF, INOS, Ki67 gibi çeşitli angiogenezis ve proliferasyon faktörlerinin yanı sıra Enamelizin ve benzeri matriks metalloproteinazeler ile Laminin ve Enamelin olarak nitelendirilen organik matriks proteinlerinin odontogen kistlerde ve tümörlerde büyüme eğilimi ve agresyon belirteci olarak izlenebileceği görülmektedir.

 Bu bölümde aktardığımız bilgilerin yetersizliği odontogen kistlerin ve odontogen tümörlerin immunohistokimyasal ve moleküler nitelikleri ile ilgili doldurulması gereken çok büyük boşluklar olduğunun kanıtıdır. Tümörler konusuna önemli kaynaklardan biri olan Dünya Sağlık Örgütü (WHO) “International Agency for Research on Cancer” çalışma grubunun 2005 yılı yayınında bile odontogen tümörler ile ilgili immunohistokimya ve moleküler patoloji verilerinin yetersizliği dikkati çekmektedir.

…ve SONUÇ
   Bu bir devrimdi; konvansiyonel boyama yöntemlerindeki renkli dünyanın yansımalarını ortadan kaldıran ve “kahverenginin egemenliği” ile sonlanan bir devrim. Bu devrimi Türkiye’ye getirenler ve ilk çalışmaları yapanlarla ilgili yazılı bilgilere ulaşamadık. Ancak, bu devrimin başlangıcı olan “immunofloresans mikroskopi” tekniğinin İstanbul’daki ilk uygulamalarının 1970li yılların sonlarına doğru İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Dermatoloji Kürsüsü’nden Prof.Dr. Türkan Saylan’ın ve Dişhekimliği Fakültesi Patoloji Kürsüsü'nden Prof.Dr. Melih Tahsinoğlu’nun WHO desteği ile kurdukları laboratuvarda başladığını biliyoruz. Bu laboratuvarda Lepra hastalarıyla ilgili araştırmaların yanı sıra İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Nefroloji (Prof.Dr. N.Koçak), Nöroloji (Prof.Dr. C.Özdemir), Romatoloji (Doç.Dr. M.Koniçe) hastalarından alınan biyopsilerin incelenmesi yapılıyordu.
   İmmunohistokimya alanında 1980’de başlayan yayın patlaması 21.yüzyılın ilk 5 yılında 95.000 çalışmanın yayınlanmasıyla tepe noktasına ulaştı. İzlenmesi olanaksız yeni yeni dergilerde yüzlerce yeni marker, yöntem modifikasyonları, robotlarla uygulanan yeni teknikler öneren binlerce yayın. Yaşamının önemli bir bölümünü mikroskop karşısında geçirenlerin saatlerce inceledikleri hücreler ve oluşturdukları kümelerden tanıya gitmekte çektikleri zorlukların büyük bölümünü gideren bir teknoloji.
Önümüzdeki birkaç yıl içinde gelmesi beklenen bilgisayar destekli mikroskopi teknikleri gerçekleştiğinde, örneğin, pozitif boyanan hücre oranını belirleyerek bir tümördeki proliferasyon hızını, metastaz gücünü ve prognoz olasılıklarını saptayacak, belki de tedavi protokolü bile önerilebilecek sistemlerle çalışılacaktır. Bu aşamada klinik patolojinin yönünü klinik onkopatolojiye çevirmesi kaçınılmaz olacaktır.
İmmunohistokimya laboratuvarı robot teknolojisini ayaklarımıza getiren üretici firmaların birbirleriyle olan kıyasıya savaşı ”robot mikroskop teknolojisini” ile sürecek gibi görünmektedir.

Bilgilendirme: Sunulan monografinin amacı "mikroskop ve mikroskopi teknikleri"nin tarihçesi konusunda bilgi vermektir. Yararlanılan kaynakların büyük bölümü bulunabilmiştir.  Bulunamayan kaynaklar ise, tarihçeyi bozmamak ve sizlerin bulabileceğini umarak verilmektedir.

KAYNAKLAR

·         1. Long E. A history of pathology. Dover Publications, NewYork, 1965

·         2. van den Tweel JG, Taylor CR. A brief history of pathology. Virchows Arch, 457:3–10, 2010

·         3. Buikstra J, Roberts C. The Global History of Paleopathology: Pioneers and Prospects. Oxford University Press, Oxford, New York, 2012

·         4. Enoch J. First known lenses originating in Egypt about 4600 years ago! Hindsight, 31:9-17, 2000

·         5. Darrigol O. A History of Optics. Oxford Press, Oxford-New York, 2012

·         6. Calvo ML, Enoch JM. Introduction to the history of lenses and visual corrections; A reference to Spain and the Spanish colonies in the New World (XV-XVI C.). Revista Cubana de Fisica, 22: 3-12, 2005

·         7. Wade NJ. A Natural History of Vision, MIT Press, Cambridge, MA, 1998

·         8. Harl KW. Great Ancient Civilizations of Asia Minor. The Great Courses No.363, Tulane University, Chantilly, VA, 2009

·         9. Karal EZ. Osmanlı Tarihi, VII.cilt. Türk Tarih Kurumu, Ankara, 2011

·         10. Allen SH. Finding the Walls of Troy. University of California Press, Berkeley-Los Angeles-London, 1999

·         11. Fechner RE. A Brief History of Head and Neck Pathology. Mod Pathol, 15: 221–228, 2002

·         12. Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2008

·         13. Marrack J. Nature of antibodies. Nature, 133: 292-293, 1934

·         14. Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Immunological properties of an antibody containing a fluorescence group. Proc Soc Exp Biol Med, 47: 200-202, 1941 

·         15. Coons AH, Kalpan MH. Localization antigens in tissue cells. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med, 91: 1-13, 1950

·         16. Coons AH. Histochemistry with labeled antibody. Int Rev Cytol, 5: 1-23, 1956

·         17. Avrameas S, Uriel J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D, 262: 2543-2545, 1966

·         18. Nakane PK, Pierce GB. Enzyme labeled antibodies: Preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem, 14: 929-931,1966

·         19. Nakane PK. Simultaneous localization of multiple tissue antigens using the peroxidase-labeled antibody method: a study on pituitary glands of the rat. J Histochem Cytochem, 16: 557-560, 1968

·         20. Mason TE, Phifer RF, Spicer SS. An immunoglobulin-enzyme bridge method for localizing tissue antigens. J Histochem Cytochem, 17: 563-569, 1969

·         21. Sternberger LA, Hardy PH Jr, Cuculis JJ, Meyer HG. The unlabeled antibody-enzyme method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorse-radish peroxidase) and its use in identification of spirochetes. J Histochem Cytochem, 18: 315-333, 1970

·         22. Mason DY, Sammons R. Alkaline phosphatase and peroxidase for double immunoenzymatic labeling of cellular constituents. J Clin Pathol, 31: 454-460, 1978

·         23. Mason DY, Sammons R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. J Immunol Methods, 20: 317-324, 1978

·         24. Cordell JL, Falini B, Erber WN, et al. Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes). J Histochem Cytochem. 32: 219-229, 1984

·         25. Aasmundstad TA, Haugen OA, Johannesen E, et al. Oestrogen receptor analysis: correlation between enzyme immunoassay and immunohistochemical methods. J Clin Pathol, 45: 125-129, 1992

·         26. Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of avidin-biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem, 29: 577-580, 1981

·         27. Hsu SM, Raine L, Fanger H. A comparative study of the peroxidase-antiperoxidase method and an avidin-biotin complex method for studying polypeptide hormones with radioimmunoassay antibodies. Am J Clin Pathol, 75: 734-738, 1981

·         28. Hsu SM, Raine L, Fanger H. The use of antiavidin antibody and avidinbiotin-peroxidase complex in immunoperoxidase technics. Am J Clin Pathol, 75: 816–821, 1981

·         29. Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of avidin-biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem, 29: 577-580, 1981

·         30. Hsu SM, Raine L. Protein A, avidin, and biotin in immunohistochemistry. J Histochem Cytochem, 29: 1349-353, 1981

·         31. Hsu SM, Raine L. Protein A, avidin, and biotin in immunohistochemistry. J Histochem Cytochem, 29: 1349-1353, 1981

·         32. Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagn Immunol 1984; 2: 161-166.

·         33. Nadji M. Immunoperoxidase techniques: I. Facts and artifacts. Am J Dermatopathol, 8: 32-36, 1986

·         34. Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, Litt GJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods, 125: 279-285, 1989

·         35. Adams JC. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. J Histochem Cytochem, 40: 1457-1463, 1992

·         36. Wiltshire S, O’Malley S, Lambert J, et al. Detection of multiple allergen-specific IgE on microarrays by immunoassay with rolling circle amplification. Clin Chem, 46: 1990-1993, 2000

·         37. Wiltshire S, O’Malley S, Lambert J, et al. Detection of multiple allergen-specific IgE on microarrays by immunoassay with rolling circle amplification. Clin Chem, 46: 1990-1993, 2000

·         38. Gusev Y, Sparkowski J, Raghunathan J, et al. Rolling circle amplification. A new approach to increase sensitivity for immunohistochemistry and flow cytometry. Am J Pathol, 159: 63-75, 2001

·         39. Chilosi M, Lestani M, Pedron S, Met al. A rapid immunostaining method for frozen sections. Biotech Histochem, 69: 235-239, 1994

·         40. Werner M, Chott A, Fabiano A, Battifora H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol, 24: 1016-1019, 2000

·         41. Alves VA, Wakamatsu A, Kanamura CT, et al. The importance of fixation in immunohistochemistry: distribution of vimentin and cytokeratins in samples fixed in alcohol and formol. Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo, 47: 19-24, 1992

·         42. Cattoretti G, Becker MH, Key G, et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol, 168: 357-363, 1992

·         43. Taylor CR. An exaltation of experts: concerted efforts in the standardization of immunohistochemistry. Hum Pathol, 25: 2-11, 1994

·         44. Swanson PE. HIERanarchy: the state of the art in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol, 107: 139-140, 1997

·         45. Taylor CR. The total test approach to standardization of immunohisto-chemistry Arch Pathol Lab Med, 124: 945-951, 2000

·         46. Teruya-Feldstein J. The immunohistochemistry laboratory: looking at molecules and preparing for tomorrow. Arch Pathol Lab Med, 134: 1659-1665, 2010

·         47. True LD. Quantitative immunohistochemistry: a new tool for surgical pathology? Am J Clin Pathol, 90: 324-325, 1988

·         48. Becker RL., Jr Standardization and quality control of quantitative microscopy in pathology. J Cell Biochem, 17G (Supp l): 199-204, 1993

·         49. Kubbutat MH, Key G, Duchrow M, et al. Epitope analysis of antibodies recognising the cell proliferation associated nuclear antigen previously defined by the antibody Ki-67 (Ki-67 protein). J Clin Pathol, 47: 524-528, 1994

·         50. Ma W, Lozanoff S. A full color system for quantitative assessment of histochemical and immunohistochemical staining patterns. Biotech Histochem,74: 1-9, 1999

·         51. Cross SS. Observer accuracy in estimating proportions in images: implications for the semiquantitative assessment of staining reactions and a proposal for a new system. J Clin Pathol, 54: 385-390, 2001

·         52. Seidal T, Balaton AJ, Battifora H. Interpretation and quantification of immunostains. Am J Surg Pathol, 25: 1204-1207, 2001

·         53. Brey EM, Lalani Z, Johnston C, et al. Automated selection of DAB-labeled tissue for immunohistochemical quantification. J Histochem Cytochem, 51: 575-584 2003

·         54. Taylor CR, Levenson RM. Quantification of immunohistochemistry—issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.  Histopathology, 49: 411-424, 2006

·         55. Torlakovic E, Torlakovic G, Nguyen PL, et al. The value of anti-pax-5 immunostaining in routinely fixed and paraffin-embedded sections: a novel pan pre-B and B-cell marker. Am J Surg Pathol, 26: 1343-1350, 2002

·         56. Shi SR, Liu C, Taylor CR. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen retrieval technique: from experiments to hypothesis. J Histochem Cytochem, 39: 741-748, 2006

·         57. Yaziji H, Barry T. Diagnostic immunohistochemistry: what can go wrong? Adv Anat Pathol, 13: 238-46, 2006

·         58. Brigati DJ, Budgeon HT, Under ER. Immunocytochemistry is automated: development of a robotic workstation based upon the capillary action principle. J Histotechnol, 11: 165-183, 1988

·         59. Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S, et al. The EnVision™ system: a new immuno-histochemical method for diagnostics and research. Critical comparison with the APAA P, ChemMateTM, CSA, LABC, and SABC techniques. J Clin Pathol, 51: 506-511, 1988

·         60. Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic Applications. 3rd ed. New York: Saunders, 2010

·         61. Kumar GL, Rudbeck L. Education Guide-Immunohistochemical (IHC) Staininig Methods, 5th ed. DAKO N America, Carpinteria CA, 2009

·         62. Richard J Cole, Clive R. Taylor. Immunohistochemistry and related marking techniques Chapter no.8. In, Ivan Damjanov James Linder(ed). Anderson’s Pathology Volume I, 10th edition. pp 136-175, Elsevier, St. Louis Mosby, 2009

·         63. Suvarna K, Layton C, Bancroft J. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Edition, Elsevier, 2013

·         64. Peter Jackson and David Blythe. Immunohistochemical techniques Chapter no 21. In, John D Bancroft, Marilyn Gamble (ed). Theory and practice of Histological techniques, 6th edition.  pp 433-472, Churchill Livingstone, Elsevier, 2008

·         65. Coleman WB, Tsongalis GJ. Molecular Pathology: The Molecular Basis of Human Disease. Academic Press, San Diego-Oxford, 2009

·         66. Nadji M. Immunoperoxidase techniques: II. Application to cutaneous neoplasms. Am J Dermatopathol, 8: 124-129, 1986

·         67. Leong AS, Wright J. The contribution of immunohistochemical staining in tumour diagnosis. Histopathology, 11: 1295-1305, 1987

·         68. Shi ZR, Itzkowitz SH, Kim YS. A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J Histochem Cytochem, 36: 317-322, 1988

·         69. Wrba F, Gullick WJ, Fertl H, et al. Immunohistochemical detection of the c-erbB-2 proto-oncogene product in normal, benign and malignant cartilage tissues. Histopathology, 15: 71-76, 1989

·         70. Bhatnagar J, Tewari H, Bhatnagar M, Austin GE. Comparison of carcinoembryonic antigen in tissue and serum with grade and stage of colon cancer. Anticancer Res, 19: 2181-2187, 1999

·         71. Lindblom A, Liljegren A. Tumor markers in malignancies. Br Med J, 320: 424-427, 2000

·         72. Guerry M, Vabre L, Talbot M, et al. Prognostic value of histological and biological markers in pharyngeal squamous cell carcinoma: a case-control study. Br J Cancer, 77(11): 1932–1936, 1998

·         73. Furlong MA, Mentzel T, Fanburg-Smith JC. Pleomorphic rhabdomyosarcoma in adults: a clinicopathologic study of 38 cases with emphasis on morphologic variants and recent skeletal muscle-specific markers. Mod Pathol, 4: 595-603, 2001

·         74. Bodey B. The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms. Expert Opin Biol Ther, 2 : 371-393, 2002

·         75. Coindre JM. Immunohistochemistry in the diagnosis of soft tissue tumours. Histopathology, 43: 1-16, 2003

·         76. Jaffer S, Bleiweiss IJ. Beyond hematoxylin and eosin —the role of immunohistochemistry in surgical pathology. Cancer Invest, 22: 445-465, 2004

·         77. Travis WD, Brambilla E, Müller-Hermelink HK, Harris CC. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus, and Heart. IARC Press, Lyon, 2004

·         78. Hakuma N, Betsuyaku T, Kinoshita I, et al. High incidence of extracellular matrix metalloproteinase inducer expression in non-small cell lung cancers. Association with clinicopathological parameters. Oncology, 72: 197-204, 2007

·         79. Morgenstern DA, Rees H, Sebire NJ, et al. Rhabdomyosarcoma subtyping by immunohistochemical assessment of myogenin: Tissue array study and review of the literature. Pathol Oncol Res, 14: 233-238, 2008

·         80. Parra ER, Park JY, Saito DM, et al. Prognostic index expression of cyclin-D1, cerbB-2 and VEGF: metastases vs corresponding primary cancers and metastatic vs non-metastatic adenocarcinomas. Histol Histopathol, 23: 987-993, 2008

·         81. Andriole GL, Crawford ED, Grubb RL 3rd, et al.  Mortality results from a randomized prostate-cancer screening trial. N Engl J Med, 360: 1310-1319, 2009

·         82. Capelozzi VL.  Role of immunohistochemistry in the diagnosis of lung cancer, J Bras Pneumol, 35: 375-382, 2009

·         83. Martins SJ, Takagaki TY, Silva AG, et al. Prognostic relevance of TTF-1 and MMP-9 expression in advanced lung adenocarcinoma. Lung Cancer, 64: 105-109 2009

·         84. Schröder FH, Hugosson J, Roobol MJ, et al.  Screening and prostate-cancer mortality in a randomized European study. N Engl J Med, 360: 1320-1328, 2009

·         85. Sharma S. Tumor markers in clinical practice: General principles and guidelines. Indian J Med Paediatr Oncol, 30: 1-8, 2009

·         86. Leite KRM, Srougi M, Sanudo A, et al. The use of immunohistochemistry for diagnosis of prostate cancer. Int Braz J Urol, 36: 583-590, 2010

·         87. Gulmann C, Paner GP, Parakh RS, et al. Immunohistochemical profile to distinguish urothelial from squamous differentiation in carcinomas of urothelial tract.  Human Pathol, 44: 164-172, 2013

·         88. Hoeller S, Zhou Y, Kanagal-Shamanna R, et al. Composite mantle cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma: a clinicopathologic and molecular study. Hum Pathol, 44: 110-121, 2013

·         89. Ohsie SJ, Sarantopoulos GP, Cochran AJ, Binder SW. Immunohistochemical characteristics of melanoma. J Cutan Pathol, 35: 433–444, 2008

·         90. Voss JS, Holtegaard LM, Kerr SE, et al. Molecular profiling of cholangiocarcinoma shows potential for targeted therapy treatment decisions. Human Pathol, 44: 1216-1222, 2013

·         91. Hsi ED. A practical approach for evaluating new antibodies in the clinical immunohistochemistry laboratory. Arch Pathol Lab Med, 125: 289-294, 2001

·         92. Press MF, Pike MC, Chazin VR, et al. Her-2/neu expression in nodenegative breast cancer: direct tissue quantitation by computerized image analysis and association of overexpression with increased risk of recurrent disease. Cancer Res, 53: 4960-4970, 1993

·         93. Biesterfeld S, Veuskens U, Schmitz FJ, et al. Interobserver reproducibility of immunocytochemical estrogen- and progesterone receptor status assessment in breast cancer. Anticancer Res 1996; 16: 2497-2500, 1996

·         94. Reed W, Hannisdal E, Boehler PJ, et al. The prognostic value of p53 and c-erb B-2 immunostaining is overrated for patients with lymph node negative breast carcinoma: a multivariate analysis of prognostic factors in 613 patients with a follow-up of 14-30 years. Cancer 88: 804-813,2000

·         95. Lehr HA, Jacobs TW, Yaziji H, et al. Quantitative evaluation of HER-2/neu status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization and by immunohistochemistry with image analysis. Am J Clin Pathol, 115: 814-822, 2001

·         96. Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing accuracy. Adv Anat Pathol, 12: 10-19, 2005

·         97. Hicks DG, Tubbs RR. Assessment of the HER2 status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines. Hum Pathol, 36: 250-261,2005

·         98. Yeh IT, Mies C. Application of immunohistochemistry to breast lesions, Arch Pathol Lab Med, 132: 349-358, 2008

·         99. Currie MJ, Beardsley BE, Harris GC, et al.  Immunohistochemical analysis of cancer stem cell markers in invasive breast carcinoma and associated ductal carcinoma in situ: relationships with markers of tumor hypoxia and microvascularity. Human Pathol,  44: 402-411, 2013

·         100. Gordower L, Decaestecker C, Kacem Y, et al. Galectin-3 and galectin-3-binding site expression in human adult astrocytic tumours and related angiogenesis. Neuropathol Appl Neurobiol, 25: 319-330, 1999

·         101. Wang WS, Lin JK, Chiou TJ, et al. Preoperative carcinoembryonic antigen level as an independent prognostic factor in colorectal cancer: Taiwan experience. Jpn J Clin Oncol, 30: 12-16, 2000

·         102. Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 93: 56-74, 2002

·         103. Nogami T, Kuyama K, Nagura H, Yamamoto N. A histochemical and immunohistochemical study of malignant transformation of oral leukoplakia. The 11th Biennial Meeting of the IAOP (Abstract 54). J Oral Pathol Med, 31: 304, 2002

·         104. Reibel J. Prognosis of oral pre-malignant lesions: significance of clinical, histopathological, and molecular biological characteristics. Crit Rev Oral Biol Med, 14: 47-62, 2003

·         105. Scully C, Sudbo J, Speight PM. Progress in determining the malignant potential of oral lesions. J Oral Pathol Med, 32: 251-256, 2003

·         106. Çöloğlu AS. Oral Patoloji (Ağız Patolojisi), TC Yeditepe Üniversitesi Yayınları No.37, Mor Ajans, İstanbul, 2007

·         107. Gale N, Zidar N. Benign and Potentially Malignant Lesions of the Squamous Epithelium and Squamous Cell Carcinoma. “ Pathology of the Head and Neck, Eds.A. Cardesa, P. Slootweg, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, pp1-29, 2006

·         108. Scapoli L, Palmieri A, Lo Muzio L, et al. MicroRNA expression profiling of oral carcinoma identifies new markers of tumor progression. Int J Immunopathol Pharmacol, 23: 1229-1234,2010

·         109. Feller LL, Khammissa RR, Kramer BB, Lemmer JJ. Oral squamous cell carcinoma in relation to field precancerisation: pathobiology. Cancer Cell Int, 13: 31-38, 2013

·         110. Kahn MA, Mincer HH, Dockter ME, Hermann-Petrin JM. Comparing flow cytometric analysis and nucleolar organizer region enumeration in archival oral premalignant lesions. J Oral Pathol Med, 22: 257-262,1993

·         111. Saito T, Yamashita T, Notani K, et al. Flow cytometric analysis of nuclear DNA content in oral leukoplakia: relation to clinicopathologic findings. Int J Oral Maxillofac Surg, 24: 44-47, 1995

·         112. Bloor BK, Seddon SV, Morgan PR Gene expression of differentiation-specific keratins in oral epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma. Oral Oncol, 37: 251-261, 2001

·         113. Jiang WW, Fujii H, Shirai T, et al. Accumulative increase of loss of heterozygosity from leukoplakia to foci of early cancerization in leukoplakia of the oral cavity. Cancer, 92: 2349-2356, 2001

·         114. Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part I: Molecular methods. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 92: 650-669, 2001

·         115. Sudbö J, Bryne M, Johannessen AC, et al. Comparison of histological grading and large-scale genomic status (DNA ploidy) as prognostic tools in oral dysplasia. J Pathol, 194: 303-310,2001

·         116. Sudbö J, Ried T, Bryne M, et al. Abnormal DNA content predicts the occurrence of carcinomas in non-dysplastic oral white patches. Oral Oncol, 37: 558-565, 2001

·         117. Patel V, Leethanakul C, Gutkind JS. New approaches to the understanding of the molecular basis of oral cancer. Crit Rev Oral Biol Med, 12: 55-63, 2001

·         118. Schwartz JL, Muscat JE, Baker V, et al. Oral cytology assessment by flow cytometry of DNA adducts, aneuploidy, proliferation and apoptosis shows differences between smokers and non-smokers. Oral Oncol, 39: 842-854, 2003

·         119. Maraki D, Becker A, Boecking A. Cytologic and DNA-cytometric very early diagnosis of oral cancer.  J Oral Pathol Med, 33: 398-404, 2004

·         120. Lin SC, Chang MF, Chung MY, et al. Frequent microsatellite alterations of chromosome locus 4q13.1 in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 34: 209-213, 2005

·         121. Wreesmann VB, Singh B. Chromosomal aberrations in squamous cell carcinomas of the upper aerodigestive tract: biologic insights and clinical opportunities.  J Oral Pathol Med, 34: 449-459, 2005

·         122. Chen R, Yang K, Zhao NB, et al. Abnormal expression of PER1 circadian-clock gene in oral squamous cell carcinoma. Onco Targets Ther, 5: 403-407, 2012

·         123. Jawert F, Hasséus B, Kjeller G, et al. Loss of 5-hydroxymethylcytosine and TET2 in oral squamous cell carcinoma. Anticancer Res, 33: 4325-4328, 2013

·         124. Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res, 54: 4855-4878, 1994

·         125. Slootweg PJ, Koole R, Hordijk GJ. The presence of p53 protein in relation to Ki-67 as cellular proliferation marker in head and neck squamous cell carcinoma and adjacent dysplastic mucosa. Eur J Cancer B Oral Oncol, 30(B): 138-141, 1994

·         126. Piffko J, Bankfalvi A, Öfner D, et al. Expression of p53 protein in oral squamous cell carcinomas and adjacent non-tumorous mucosa of the floor of the mouth: an archival immunohisto-chemical study using wet autoclave pretreatment for antigen retrieval. J Oral Pathol Med, 24: 337-342,1995

·         127. Regezi JA, Zarbo RJ, Regev E, et al. p53 protein expression in sequential biopsies of oral dysplasias and in situ carcinomas. J Oral Pathol Med, 24: 18–22, 1995

·         128. Dowell SP, Ogden GR. The use of antigen retrieval for immunohistochemical detection of p53 over-expression in malignant and benign oral mucosa: a cautionary note. J Oral Pathol Med, 25: 60-64, 1996

·         129. Kushner J, Bradley G, Jordan RC. Patterns of p53 and Ki-67 protein expression in epithelial dysplasia from the floor of the mouth. J Pathol, 183: 418-423, 1997

·         130. Cruz IB, Snijders PJ, Meijer CJ, et al. p53 expression above the basal cell layer in oral mucosa is an early event of malignant transformation and has predictive value for developing oral squamous cell carcinoma. J Pathol, 184: 360-368, 1998

·         131. Kaplan I, Vered M, Moskona D, et al. An immunohistochemical study of p53 and PCNA in inflammatory papillary hyperplasia of the palate: a dilemma of interpretation. Oral Dis, 4: 194-199, 1998

·         132. Warnakulasuriya KAAS, Tavassoli M, Johnson NW. Relationship of p53 overexpression to other cell cycle regulatory proteins in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 27: 376-381, 1998

·         133. Qin GZ, Park JY, Chen SY, Lazarus P (1999) A high prevalence of p53 mutations in pre-malignant oral erythroplakia. Int J Cancer, 80: 345-348, 1999

·         134. Cruz IB, Meijer CJ, Snijders PJ, et al. p53 immunoexpression in non-malignant oral mucosa adjacent to oral squamous cell carcinoma: potential consequences for clinical management. J Pathol, 191: 132-137, 2000

·         135. Nylander K, Dabelsteen E, Hall PA. The p53 molecule and its prognostic role in squamous cell carcinomas of the head and neck. J Oral Pathol Med, 29: 413-425, 2000

·         136. Shahnavaz SA, Regezi JA, Bradley G, et al. p53 gene mutations in sequential oral epithelial dysplasias and squamous cell carcinomas. J Pathol,190: 417-422, 2000

·         137. Piattelli A, Rubini C, Fioroni M, et al. Prevalence of p53, bcl-2, and Ki-67 immunoreactivity and of apoptosis in normal oral epithelium and in premalignant and malignant lesions of the oral cavity. J Oral Maxillofac Surg, 60: 532-540, 2002

·         138. Kurokawa H, Zhang M, Matsumoto S, et al. The relationship of the histologic grade at the deep invasive front and expression of Ki-67 antigen and p53 protein in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 34: 602-607, 2005

·         139. Fan G-K, Chen J, Ping F, Geng Y. Immunohistochemical analysis of P57(kip2), p53 and hsp60 expressions in premalignant and malignant oral tissues. Oral Oncol, 42: 147-153, 2006

·         140. Lujambio A, Akkari L, Simon J, et al. Non-cell-autonomous tumor suppression by p53.  Cell, 153: 449-460, 2013

·         141. Shiogama S, Yoshiba S, Soga D, et al. Aberrant Expression of EZH2 Is Associated with Pathological Findings and P53 Alteration. Anticancer Res, 33: 4309-4317, 2013

·         142. Chen YK, Hsue SS, Lin LM. Expression of p63 protein and mRNA in oral epithelial dysplasia. J Oral Pathol Med, 34: 232-239, 2005

·         143. Mandel U, Langkilde NC, Orntoft TF, et al. Expression of histo-blood-group-A/B-gene-defined glycosyltransferases in normal and malignant epithelia: correlation with A/B-carbohydrate expression. Int J Cancer, 52: 7-12, 1992

·         144. Carey TE, Nair TS, Chern C, et al. Blood group antigens and integrins as biomarkers in head and neck cancer: is aberrant tyrosine phosphorylation the cause of altered alpha 6 beta 4 integrin expression? J Cell Biochem Suppl,17(F): 223-232, 1993

·         145. Dabelsteen E. ABO blood group antigens in oral mucosa. What is new? J Oral Pathol Med, 31: 65-70, 2002

·         146. Bosch FX, Ouhayoun JP, Bader BL, et al.  Extensive changes in cytokeratin expression patterns in pathologically affected human gingiva. Virchows Arch B Cell Pathol Mol Pathol, 58: 59-77, 1989

·         147. Heyden A, Huitfeldt HS, Koppang HS, et al. Cytokeratins as epithelial differentiation markers in premalignant and malignant oral lesions. J Oral Pathol Med, 21: 7-11, 1992

·         148. Su L, Morgan PR, Lane EB. Keratin 14 and 19 expression in normal, dysplastic and malignant oral epithelia. A study using in situ hybridization and immunohisto-chemistry. J Oral Pathol Med, 25: 293-301, 1996

·         149. Chu PG, Weiss LM. Keratin expression in human tissues and neoplasms. Histopathology, 40: 403-439, 2002

·         150. Moll R, Divo M, Langbein L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol, 129: 705-733, 2008

·         151. Warnakulasuriya KA, Johnson NW. Importance of proliferation markers in oral pathology. Curr Top Pathol, 90: 147–177, 1996

·         152. Wong YK, Lin SC, Chang CS, et al. Cyclin D1 genotype in areca-associated oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 32: 265-270, 2003

·         153. Schoelch ML, Regezi JA, Dekker NP, et al. Cell cycle proteins and the development of oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol, 35: 333-342, 1999

·         154. Schoelch ML, Le QT, Silverman S Jr, et al. Apoptosis-associated proteins and the development of oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol, 35: 77-85, 1999

·         155. Steinhusen U. Weiske J, Badock V, et al. Cleavage and shedding of E-cadherin after induction of apoptosis.  J Biol Chem, 276: 4972-4980, 2001

·         156. Shintani S, Mihara M, Nakahara Y, et al. Expression of cell cycle control proteins in normal epithelium, premalignant and malignant lesions of oral cavity. Oral Oncol, 38: 235-243, 2002

·         157. Lo Muzio L, Pannone G, Leonardi R, et al. Survivin, a potential early predictor of tumor progression in the oral mucosa. J Dent Res, 82: 923-928, 2003

·         158. Loro LL, Vintermyr OK, Johannessen AC. Cell death regulation in oral squamous cell carcinoma: methodological considerations and clinical significance. J Oral Pathol Med, 32: 125-138, 2003

·         159. Loro LL, Vintermyr OK, Johannessen AC. Apoptosis in normal and diseased oral tissues. Oral Dis, 11: 274-287, 2005

·         160. Martinez A, Brethauer U, Rojas IG, et al. Expression of apoptotic and cell proliferation regulatory proteins in actinic cheilitis. J Oral Pathol Med, 34: 257-262, 2005

·         161. Shimane T, Kobayashi H, Takeoka M, et al. Clinical significance of apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain in oral squamous cell carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol, 115: 799-809, 2013

·         162. Srinivasan M, Jewell SD. Evaluation of TGF-alpha and EGFR expression in oral leukoplakia and oral submucous fibrosis by quantitative immunohistochemistry. Oncology, 61: 284-292, 2001

·         163. Sato S, Miyauchi M, Ogawa I, et al. Inhibition of CD44v9 upregulates the invasion ability of oral squamous cell carcinoma cells. Oral Oncol, 39: 27-30, 2003

·         164. Bryne M, Reibel J, Mandel U, Dabelsteen E. Expression of mucin type carbohydrates may supplement histologic diagnosis in oral premalignant lesions. J Oral Pathol Med, 20: 120-125, 1991

·         165. Nitta T, Sugihara K, Tsuyama S, Murata F. Immunohistochemical study of MUC1 mucin in premalignant oral lesions and oral squamous cell carcinoma: association with disease progression, mode of invasion, and lymph node metastasis. Cancer, 88: 245-254, 2000

·         166. Yuvaraj S, Griffin AC, Sundaram K, et al. A novel function of CXCL13 to stimulate RANK ligand expression in oral squamous cell carcinoma cells. Mol Cancer Res, 7: 1399-1407, 2009

·         167. Kimura S, Naganuma S, Susuki D, et al. Expression of microRNAs in squamous cell carcinoma of human head and neck and the esophagus: miR-205 and miR-21 are specific markers for HNSCC and ESCC. Oncol Rep, 23: 1625-1633, 2010

·         168. Kobayashi H, Sagara J, Masumoto J, et al. Shifts in cellular localization of moesin in normal oral epithelium, oral epithelial dysplasia, verrucous carcinoma and oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 32: 344-349, 2003

·         169. Pazouki S, Chisholm DM, Adi MM, et al. The association between tumour progression and vascularity in the oral mucosa. J Pathol, 183: 39-43, 1997

·         170. Makino T, Kuyama K, Yamamoto H, Nagura H. A study of lymphatic density and lymphangiogenesis in oral squamous cell carcinoma. The 11th Biennial Meeting of the IAOP (Abstract 45). J Oral Pathol Med, 31: 302, 2002

·         171. Sedivy R, Beck-Mannagetta J, Haverkampf C, et al. Expression of vascular endothelial growth factor-C correlates with the lymphatic microvessel density and the nodal status in orak squamous cell cancer. J Oral Pathol Med, 32: 455-460, 2003

·         172. Iamaroon A, Pongsiriwet S, Jittidecharaks S, et al. Increase of mast cells and tumor angiogenesis in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 32: 195-199, 2003

·         173. Petrovic N, Bhagwat SV, Ratzan WJ, et al. CD13/APN transcription is induced by RAS/MAPK-mediated phosphorylation of Ets-2 in activated endothelial cells. J Biol Chem, 278: 49358-49368, 2003

·         174. Bhagwat SV, Petrovic N, Okamoto Y, Shapiro LH. The angiogenic regulator CD13/APN is a transcriptional target of Ras signaling pathways in endothelial morphogenesis. Blood, 101: 1818-1826, 2003

·         175. Nikitakis NG, Rivera H, Lopes MA, et al. Immunohistochemical expression of angiogenesis-related markers in oral squamous cell carcinomas with multiple metastatic lymph nodes, Am J Clin Pathol, 119: 574-586, 2003

·         176. Watanabe S, Kato M, Kotani I, et al. Lymphatic vessel density and Vascular Endothelial Growth Factor expression in squamous cell carcinomas of lip and oral cavity: A clinicopathological analysis with immunohistochemistry using antibodies to D2-40, VEGF-C and VEGF-D.Yonago Acta Med, 56: 29-37, 2013

·         177. Rojas IG, Martinez A, Pineda A, Spencer ML, Jiménez M, Rudolph MI. Increased mast cell density and protease content in actinic cheilitis. J Oral Pathol Med, 33: 567-573, 2004

·         178. Shieh YS, lee HS, Shiah SG, et al. Role of angiogenic and non-angiogenic mechanisms in oral squamous cell carcinoma: correlation with histologic differentiation and tumor progression. J Oral Pathol Med, 33: 601-606, 2004

·         179. Xuan M, Fang YR, Wato M, et al. Immunohistochemical co-localization of lymphatics and blood vessels in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med, 34: 334-339, 2005

·         180. Rojas IG, Spencer ML, Martinez A, et al. Characterization of mast cell subpopulations in lip cancer. J Oral Pathol Med, 34: 268-273, 2005

·         181. Johnstone S, Logan RM. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in oral dysplasia and oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol, 42: 337-342, 2006

·         182. Salehinejad J, Zare-Mahmoodabadi R, Saghafi S, et al. Immunohistochemical detection of p53 and PCNA in ameloblastoma and adenomatoid odontogenic tumor. J Oral Sci, 53: 213-217, 2011

·         183. Takata T, Zhao M, Uchida T, et al. Immunohistochemical detection and distribution of Enamelysin (MMP-20) in human odontogenic tumors. J Dental Res, 79: 1608-1613, 2000

·         184. Abiko Y, Murata M, Ito Y, et al. Immunohistochemical localization of amelogenin in human odontogenic tumors, using a polyclonal antibody against bovine amelogenin. Med Electron Misrosc, 34: 185-189, 2001

·         185. Leon JE, Mata GM, Fregnani ER, et al. Clinicopathological and immunohisto-chemical study of 39 cases of Adenomatoid Odontogenic Tumour: a multicentric study. Oral Oncol, 41: 835-842, 2005

·         186. Chen WL, Ouyang KX, Li HG, et al. Expression inducible nitric oxide synthetase and vascular endothelial growth factor in ameloblastoma. J Craniofac Surg, 20: 171-175, 2009

·         187. Alaeddini M, Salah S, Dehghan F, et al. Comparision of angiogenesis in keratocyst odontogenic tumors, dentigerous cysts and amelobelastomas. Oral Dis, 15: 422-427, 2009

·         188. Ali MA. Expressions of extracellular matrix metalloproteinase inducer in adontogenic cysts. Oral Surg Oral Med Oral Path. L Oral Radiol Endod, 106: 258-283, 2008

·         189. Tete S, Mastrangelo F, Grimaldi S. Immunohistochemical evaluation of CD31 in human cystic radicular lesions and in keratocyst. Int J Immunopathol Pharmacol, 18: 39-45, 2005

·         190. Seifi S, Shafaie S, Ghadiri S. Microvessel density in follicular cysts, keratocystic odontogenic tumours and ameloblastomas. Asian Pacific J Cancer Prev, 12: 351-356, 2011

·         191. Ayoub MS, Baghdadi HM, El-Kholy M. Immunohistochemical detection of laminin-1 and Ki-67 in radicular cysts and keratocystic odontogenic tumors. BMC Clin Pathol, 11: 4 -9, 2011

·         192. Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D. Pathology and Genetics of Head and Neck Tumors. IARC Press, Lyon, 2005